免疫熒光染色實驗服務
一、制片
選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通優(yōu)質(zhì)玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙氧基乙烷等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。
二、固定
除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，--般均應固定。
固定的作用有三:
1.防止標本從玻片上脫落。
2.除去防礙抗原抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果。
3.固定的標本易于保存，如組織切片固定后在-20%C下可保存一年而不改變其染色特性。
標本的固定原則是:
1.不能損傷細胞內(nèi)的抗原。
2.不能凝集蛋白質(zhì)。
3.不能損傷細胞形態(tài)。
4.固定后應保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結合。
三、水洗
固定后以冷的0.01 Mol/L pH7 4PBS液浸泡沖洗，后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
四、染色
染色分直接染色法與間接染色法。
1.材料與試劑
(1)熒光抗體，稀釋至應用濃度。
(2) 0.01 Mol/L pH7 .4PBS液
(3) 9份優(yōu)質(zhì)甘油加1份pH7 .4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。
(4)帶蓋方盤。
2. 直接染色法
(1)將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37°C感做30min~45min.
(2) PBS沖洗3次，每次沖洗3 min,即3x3沖洗。
(3)蒸餾水沖洗。
(4)滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
3.間接染色法
(1) 檢查抗原:
①取固定標本，加已知的免疫血清，37°C孵育30 min。
②以PBS液3x3沖洗。
③再加熒光標記的抗抗體，37°C孵育30 min。
④PBS 3x3沖洗。
⑤H2O沖洗，涼干。
⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
(2)檢查抗體:
①兔疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定。
②滴加相應抗原液(按1: 100~1: 500稀釋)， 37°C孵育30 min.
③PBS液3x3沖洗。
④加熒光抗體，37°C孵育30 min.
⑤PBS液3x3沖洗。
⑥水洗，干。
⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
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