土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒說明書
歐盟第675/92號令中初步規(guī)定在肌肉及牛奶中的四環(huán)素族化合物的總量不得超
過100ppb，在腎臟，肝臟及雞蛋中分別不得超過600 ppb，300 ppb及200ppb。
本公司的土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒使用生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等
特點。
本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)
包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和土霉素抗體，樣本土霉素藥物與固定在酶
標(biāo)板上的抗原競爭土霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)
品（樣本）中土霉素藥物的含量成反比。
- 10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。
- 96孔酶標(biāo)板：1塊
- 土霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
- 酶標(biāo)二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
- 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
- 20×濃縮復(fù)溶液：1瓶（10 mL/瓶）
- 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
- 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
- 終止液：1瓶（7mL）
- 說明書
- 蓋板膜
儀器：
- 酶標(biāo)儀（檢測波長450 nm、630 nm）
- 電子天平（精度：0.01 g）
- 離心機(jī)（4000 g及以上）
- 生化培養(yǎng)箱（可調(diào)25℃、37℃、60℃）
- 旋渦振蕩器
- 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
- 計時器
試劑：（試劑均為分析純）
試劑盒與其他藥物的交叉反應(yīng)率：
- 土霉素…………………………100%
- 金霉素…………………………240%
- 四環(huán)素…………………………200%
- 強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）……………………20%
- 復(fù)溶工作液：取1份20×濃縮復(fù)溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
- 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
- 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。
組織樣本（稀釋倍數(shù)：12）
- 準(zhǔn)確稱取1±0.01 g均質(zhì)后的組織樣品于10 mL離心管中；
- 加入5 mL去離子水，劇烈渦動2min；
- 4000 g以上，離心10 min；
- 取500ul上清液加入500ul復(fù)溶工作液（見5.1）中，渦動10min；
- 取50ul進(jìn)行檢測。
蜂蜜樣本（稀釋倍數(shù)：10）
- 精que稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中；
- 加入2mL去離子水，充分渦動1 min溶解分散；
- 取100ul溶解液加入400ul復(fù)溶工作液中，渦動1 0S混勻；
- 立即取50ul進(jìn)行檢測。
液態(tài)奶樣本方法一（稀釋倍數(shù)：10）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）
- 將采樣好的液態(tài)奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
- 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
- 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
- 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；
- 取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入450μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
- 取50 μL液體進(jìn)行分析。
液態(tài)奶樣本方法二（稀釋倍數(shù)：40）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）
- jing確量取50ul液態(tài)奶樣品于1950ul復(fù)溶工作液中；
- 充分渦動1 min混勻；
- 立即取50ul進(jìn)行檢測。
飼料（牛飼料、豬飼料）（稀釋系數(shù)：200 ）
- 準(zhǔn)確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中；
- 加入 5 mL 去離子水，充分渦動 2min 至飼料*分散；
- 4000 g 以上，離心 10 min；
- 取40 μL上清液于新的離心管中，加入1560μL 復(fù)溶工作液 ，充分渦動 30 s；
- 立即取 50μL 進(jìn)行檢測。
- 準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；
- 標(biāo)準(zhǔn)品工作液配制：分別取5個2ml離心管，標(biāo)記為0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；于每個管中加入900ul復(fù)溶工作液，于對應(yīng)管中加入100ul10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；
- 加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；
- 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)30 min；
- 洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；
- 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；
- 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；
- 終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。
- 讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標(biāo)板吸光度值。
- 設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對應(yīng)的吸光度的百分比：
- 使用半對數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
- 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測物含量。
- 試劑盒靈敏度：0.4 ppb；
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.4 ppb-10.8ppb；
- 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；
- 板間變異系數(shù)：<15%；
- B0吸光度jia值：>0.8；
- 回收率：90%±15%
- 樣品di檢測限：
組織……………………………約12ppb
蜂蜜……………………………約20ppb
液態(tài)奶樣本方法一……………約20ppb
液態(tài)奶樣本方法二……………約40ppb
飼料……………………………約600ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
- 試劑盒jia貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。
- 未使用完的酶標(biāo)板須密封保存2-8℃的環(huán)境中。
- 使用試劑盒前，請務(wù)必仔細(xì)閱讀說明書。
- 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
- 試劑使用前需搖勻，混合時應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。
- 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復(fù)使用。
- 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
- 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結(jié)果。
- 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說明試劑已污染或變質(zhì)。
- 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時間差對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。
- 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎ru眼，請在*清洗后去醫(yī)院檢查。
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