炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
【產品名稱】 將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反
通用名稱：炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
Name ：Bacillus Anthracis Detection Kit (Real-Time PCR Method) 4 擴增（核酸擴增區(qū)）
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預期用途】
炭疽是由炭疽桿菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一種人獸共患病。BA 在環(huán)境中形成芽孢，可長期、穩(wěn)定地存在于自然界中。由于 BA 的穩(wěn)定性及其致病性，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前的 BA 檢測方法主要基于病原體的培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學檢測等，但這些方法均不適合早期的快速偵檢。基于核酸檢測的熒光-PCR技術，因其靈敏度高、操作簡單、特異性好，可快速檢測炭疽病原，及時控制炭疽疫
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：
[1] 本試劑盒適用于檢測皮膚水泡液、咽拭子、可疑食物等樣本中的炭疽桿菌，用于炭疽桿菌感染的輔助診斷。
5 結果分析判定
【檢驗原理】
6.1 結果分析條件設定
本試劑對炭疽桿菌特異性基因設計引物和熒光探針[2-3]，用熒光 PCR 技術對炭疽 設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)桿菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
名 稱 規(guī) 格
核酸提取液酶液 1.5mL×2 管
唾液 50μL×1 管
BA 反應液 1.0mL×1 管
BA 陽性質控品 50μL×1 管
陰性質控品 250μL×1 管
注：
7結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。
8 檢測方法的局限性
1） 不同批號試劑不能混用。 Ø 樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
2） 試劑盒內各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列
Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；
Ø 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定 量檢測不準確的結果；
熒光定量 PCR 檢測儀。 Ø 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【標本采集】
皮膚炭疽，取水泡液 1mL；肺炭疽，采集咽拭子標本，放入標本采集管中；腸炭疽，取糞便 1g
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
9. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
【注意事項】
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；
Ø 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；
Ø 反應液應避光保存；
1. . 樣品處理（樣本處理區(qū)） Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
1.1 1 樣本前處理
固體樣本：手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μ
L 于 1.5mL 滅菌離心管中；液體樣本：直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1 111 提取
1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000rpm 離心 5min，取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；
2) DNA 的提取也可以采用深圳綠食源生物技術有限公司生產的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通 則》進行處理。
試劑 BA 反應液 酶液
用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL
將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。
3 加樣（樣本處理區(qū)）
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